《表2 胞嘧啶碱基编辑器的结构和编辑窗口》

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《碱基编辑器的开发及其在细菌基因组编辑中的应用》

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当编辑窗口存在多个胞嘧啶时，胞嘧啶核苷脱氨基酶会使其它非目标胞嘧啶也发生突变。为了减少这种情况的出现，Kim等又在BE3的基础上开发了编辑窗口更小的碱基编辑器，他们将BE3中的APOBEC1进行点突变，筛选到的突变体使编辑窗口减小到1-2 bp，从而显著增加了碱基编辑的精确性[21]。此外，现有碱基编辑器在识别编辑单链DNA上的胞嘧啶时需依赖PAM序列的存在，但往往很多编辑位点的附近没有合适的PAM序列。为了解决这一问题，Kim等将BE3中的nCas9（D10A）引入各种点突变，或替换为来源于金黄色葡萄球菌的Sa nCas9（D10A），改良版BE3识别的PAM序列更加多样，进而增加了DNA上的可编辑位点（约2.5倍）[21]。Hu等采用噬菌体辅助的连续进化（PACE）技术，筛选到可以识别更多PAM序列的Cas9，命名为x Cas9[22]。将BE3中的n Cas9（D10A）替换为xCas9（D10A）构建的xBE3，可以有效识别并编辑附近存在PAM序列为NGN、GAA、GAT的胞嘧啶碱基。x Cas9不仅可以识别更多的PAM，而且它的使用还进一步降低了编辑的脱靶率[22]。Nishimasu等进行了类似的研究工作，他们采用理性设计的方法获得了一种Cas9突变体，命名为NG-Cas9[23]。基于NG-d Cas9的编辑器可以有效编辑某些PAM序列为NG附近的胞嘧啶位点[23]。最近，研究发现DNA的甲基化修饰会降低BE3的编辑效率，Wang等将鼠源的APOBEC1替换为来自人类的APOBEC3A（hA3A），构建的hA3A-BE3可以明显减少DNA甲基化对编辑效率的影响，实现对甲基化胞嘧啶的有效编辑[24]。Ma等将Human activation-induced deaminase（hAID）的C端去除得到AIDx，将d Cas9与AIDx进行融合开发了一种Targeted AID-mediated mutagenesis（TAM），这种方法可以将胞嘧啶转化为其它3种碱基[25]。此外，Gehrke等开发的eA3A-BE3可以在不改变编辑窗口的情况下，优先编辑“TC”位点中的胞嘧啶，这种方法使碱基编辑更加精准[26]（表2）。以上研究工作，尤其是哈佛大学David R.Liu实验室的工作[13，20-22]，一方面显著提升了CBE的效率以及精确性，另一方面也大幅度增加了基因组上的可编辑位点，这些努力为其应用于哺乳动物、植物细胞基因组的精准编辑打下了良好的基础。