《表1 本研究中使用的PCR引物》

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《山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定》

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注：5′-Primer(Adapter 1-3）序列ATATGGCCATGGAGGCC 3′端相差1个碱基，允许以3种读码框表达蛋白。

分别将3个诱饵载体接种至100 m L SD/-Trp的液体培养基中，经30℃220 r·min-1过夜培养至OD600=0.8，离心后的菌体用5 m L 2×YPDA液体培养基重悬。将上述菌液与1 m L文库菌液混合，用45 m L 2×YPDA液体培养基将混合菌液全部转移至2 L三角瓶中，于30℃30 r·min-1振荡培养20～24 h。离心集菌，用50 m L 0.5×YPDA液体培养基重悬沉淀后离心，弃上清液，用0.9%Na Cl重悬菌液，分别涂布350μL至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上，于30℃倒置培养7～10 d后观察菌落生长情况。将长出的单个菌落挑至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/Ab A/X-α-Gal筛选培养基上，30℃倒置培养3～5 d后，挑取筛选培养基上呈蓝色的菌落接种于4 m L SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液体培养基；30℃200 r·min-1振荡培养3～5 d，将振荡浑浊的菌液12 000 r·min-1离心1 min收集酵母菌菌体，质粒小提筛选获得的阳性克隆。设计引物REC-F/R（表1），进行PCR鉴定。取10μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将>500 bp的PCR产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，在NCBI blastx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）进行比对，分析候选蛋白。