《表2 杨树FBL基因家族5′-RACE特异引物序列》

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《杨树miR393对FBL基因家族成员调控作用的鉴定》

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为了检测ptc-miR393对杨树FBL家族基因的剪切情况，需要通过5′-rapid amplification of cDNA ends(5′-RACE）实验对杨树8个FBL基因分别进行剪切位点的验证。首先，在ptc-miR393对FBL1-8基因可能的剪切位点下游设计2条基因特异的巢式引物（表2），之后分别与上游SMART II A接头上的通用outer引物（5′–ctaatacgactcactat agggcAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3′）和inner引物（5′–ctaatacgactcactatagggc–3′）进行两轮巢式PCR的扩增。本实验以84K杨组培苗为材料，采用LC sciences总RNA纯化试剂盒（#TRK-1001，LC sciences）提取组培苗全株的总RNA，再通过SMART?RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，TaKaRa）反转录出带SMART II A接头的第一链cDNA。将cDNA稀释10倍后，利用Takara EX Taq(#RR902A，TaKaRa）进行巢式PCR的第一轮反应，取1μL第一轮产物作为模板进行巢式PCR的第二轮反应。第二轮PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后，切取目标片段，经回收纯化后连接到PMD19-T克隆载体（#6013，Ta KaRa），转化DH5α感受态大肠杆菌，涂板后37℃过夜培养，每个菌板挑15个单克隆进行测序。