《表5 sgRNA1与sgRNA rev结合为双链gRNA》

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《微管剪切蛋白Fidgetin在黑腹果蝇神经发育过程中的功能初探》

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将合成的两条单链sgRNA DNA序列复性（见表5）．用Bbs I内切酶切割pCDF3质粒，胶回收得到有Bbs I粘性末端的线性pCDF3质粒．为了使线性的p CDF3质粒与合成的sgRNA复性得到有Bbs I粘性末端的短片段双链DNA连接，取0.5μL线性p CDF 3和4.5μL双链sgRNA于PCR管中混匀，再加入5μL solution I，放在酶连仪中16℃反应2.5 h．将酶连产物转入trans1-T1大肠杆菌感受态中（来自全式金生物技术有限公司），均匀涂在LA（加有氨苄青霉素的LB固体培养基）平板上，于37℃倒置过夜培养．挑取单菌落接种至5 m L LA液体培养基37℃培养10 h，抽提质粒并测序，将序列正确的质粒转化至trans1-T1大肠杆菌感受态并涂布至LA平板培养．挑取单菌落于100 m L LA液体培养基37℃培养12 h，用QIAGEN中提试剂盒提取质粒并纯化．由此得到pCDF3-sgRNA质粒表达载体，构建fidgetin无功能突变体果蝇的pCDF3 sgRNA表达载体命名为pCDF3-sgRNA1和p CDF3-sgRNA2质粒．