《表2 未引入错配碱基的引物等位PCR检测》

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《基于不等长引物等位特异性PCR的SNP检测方法》

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注:扩增引物组合:1:匹配日本晴SNP位点引物；2:匹配93-11 SNP位点引物；3:匹配日本晴SNP位点引物和匹配93-11 SNP位点引物的混合引物；PCR产物:+:阳性；-:阴性；G:扩增出的日本晴预期大小片段；S:扩增出的93-11预期大小片段；G+S:扩增出的日本晴与93-11预期大小片段

为了评估SNP差异碱基对等位特异性PCR特异性的影响，分别以‘日本晴’、‘93-11’、‘日本晴’/‘93-11’杂合体基因组DNA为模板，PCR扩增引物体系分别包括与‘日本晴’SNP位点匹配的上游引物与反向引物组成的引物对、‘93-11’SNP位点匹配的上游引物与反向引物组成的引物对，两条不等长引物与反向引物组成的三引物混合体系。经过优化退火温度与引物比例扩增体系后，18个SNP位点中，未引入错配碱基的引物检测结果完全符合预期的只有4个SNP标记。即‘日本晴’SNP位点匹配的上游引物与反向引物组成的引物对只能在‘日本晴’及杂合体中扩增出条带。在‘93-11’中无扩增条带，‘93-11’SNP位点匹配的上游引物与反向引物组成的引物对只能在‘日本晴’及杂合体中扩增出条带。在‘日本晴’中无扩增条带，两条不等长引物与反向引物组成的三引物混合体系，在‘日本晴’、‘93-11’均能扩增出大小有差异的单一条带，在杂合体中扩增出两条带（图2）。进一步分析发现，在6种变异类型18个SNP位点中，只有A/T，C/G变异类型中的各2个SNP位点的扩增条带符合预期，即SNP2、SNP5、SNP7、SNP9，成功率仅为22%（表2）。