《表2 Nav 1.8PCR引物》

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《木丹颗粒对痛性糖尿病周围神经病变大鼠腓肠神经电压门控Nav 1.8的影响》

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具体方法：Wistar大鼠分别在第3w、5w、9w，按说明书说明进行如下取材。（1）以20%乌拉坦（0.4ml/100g）腹腔注射进行麻醉，俯卧位固定取腓肠神经称重，置于DEPC水处理匀浆管中，加入1 mlTrizol试剂匀浆，以超声破碎机4s/次破碎2次，室温静置5min。（2）振荡转移入另一加入0.2ml氯仿Ep管中的匀浆液15s，室温静置2min，以12 000r/min离心15 min。（3）取上层水相置于另一离心管中，加入0.5ml（4℃预冷）异丙醇于离心管中，室温静置5 min，以12 000r/min离心10 min。(4）弃上清，加入1ml（4℃预冷）乙醇，以7500r/min离心5min。(5）弃乙醇，置于室温干燥10min。（6）加入50μl经DEPC处理的dH2O水，重新溶解RNA。RNA质量鉴定：以蛋白核酸分析仪测定OD值，RNA的A260/A280≥1.5～2.0。逆转录：按照宝生物工程（大连）有限公司的cDNA合成试剂盒说明操作。PCR扩增：PCR在100μl反应体积中进行。扩增条件：引物浓度20μmol/L，Mg2+6μl，5×buffer 16μl，NGF上下游引物（引物浓度20μmol/L）各1μl，甘油醛-3-磷酸脱氢酶上下游引物各1μl，逆转录产物20μl，Taq酶0.5μl（5U/μl），dH2O 55.5μl。离心混匀后，按如下条件扩增：94℃，3min，94℃，30s，56℃30s，72℃1s，循环35次，72℃，5min，见表2。产物分析：琼脂糖凝胶电泳：NGF电泳采用1.5%的琼脂糖凝胶，IGF-1电泳采用2%琼脂糖凝胶，取PCR产物5μl，加2μl上样缓冲液于琼脂糖凝胶中，以5V/cm凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE。结束电泳时，对特异性条带进行拍照记录。应用紫外凝胶成像系统对特异性条带进行半定量分析，求出相对单位。