《表1 基因的引物序列：体外法研究壳聚糖对无乳链球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用》

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《体外法研究壳聚糖对无乳链球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用》

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接种BMECs于6孔板中，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至细胞达到90%以上融合，随后采用双因素试验设计，将细胞分为对照组、S.agalactiae组、CTS组和CTS（-）+sgc组，每组4个重复。对照组更换为不添加CTS和S.agalactiae的普通维持培养液[DMEM/F-12培养液（不加青-链霉素，含2%FBS)]；S.agalactiae组更换为含S.agalactiae的细胞培养液，用S.agalactiae（MOI=50∶1）刺激细胞6 h；CTS组更换为含不同浓度CTS(31.25、125和250 mg/mL）的细胞培养液，继续培养24 h；CTS(-）+sgc组更换为含不同浓度CTS(31.25、125和250 mg/mL）的细胞培养液，继续培养24 h后，更换为含S.agalactiae的细胞培养液，用S.agalactiae(MOI=50∶1）刺激细胞6 h。随后，按照总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，然后采用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，反应条件为37℃，15 min；85℃，5 s。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参基因，采用荧光定量PCR的方法检测炎性损伤相关基因的表达量。荧光定量PCR采用2步法，反应条件为：95℃预变性30 s，1个循环；95℃延伸5 s，60℃退火30 s，40个循环。基因的引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。