《表1 荧光定量PCR引物序列》

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《环境雌激素双酚A暴露干扰仔鼠卵巢发育的研究》

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β-肌动蛋白：内参基因

使用小鼠双酚A检测试剂盒（上海润裕生物科技有限公司，Lot No，RY-12919），按照说明书操作，检测子代雌鼠血清及卵巢匀浆BPA含量。经4%多聚甲醛固定卵巢组织，进行石蜡切片，将切片分为3部分，一部分切片进行苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，观察不同剂量BPA对卵巢组织的病理损伤情况；一部分切片用于免疫组织化学检测ERα和ERβ表达变化（一抗为兔抗鼠ERα单克隆抗体ab3575(Abcam公司，美国）；兔抗鼠ERβ单克隆抗体ab3576（Abcam公司，美国）；二抗为羊抗兔多克隆抗体SV0001（博士德生物技术有限公司，北京）)；一部分切片使用原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TU-NEL）法检测细胞凋亡（TUNEL细胞凋亡检测试剂盒11684817910(Roche，美国）)。液氮保存的卵巢组织，提取总RNA进行转录组测序和荧光定量PCR检测。总RNA提取和反转录试剂盒购自普洛麦格（Promega，美国）。转录组测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司，使用Illumina测序平台Illumina HiSeq对空白对照组和50 mg/kg组卵巢进行转录组测序。测序结果经比对得到差异基因后将差异基因导入基因本体（Gene Ontology，GO）数据库和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库进行注释分析。差异基因功能按照生物进程、细胞组分和分子功能3个基因功能分类。根据基因功能的包含关系，将富集的基因功能绘制有向无环图（directed acyclic graph，DAG），DAG图为差异基因GO富集分析结果的图形化展示方式，分支代表包含关系，从上至下所定义的功能范围越来越小，DAG图可以将相似功能基因集合，并通过从属关系得到最准确的功能注释。对测序所得差异基因进行荧光定量PCR验证，荧光定量PCR采用两步法，PCR反应体系（20μL）:Roche FastStart Universal SYBR Green Master，10μL；ddH2O，6μL；10μmol/L上、下游引物各1.5μL；cDNA样品1μL(cDNA浓度5ng/μL；引物浓度0.1μmol/mL；引物列于表1扩增程序为：95℃600 s；95℃30 s，60℃10 s，45个循环。熔解曲线程序为：95℃10 s，65℃60 s然后以0.2℃/s的速度升温至97℃，最后37℃30 s冷却。引物序列由大连宝生物公司设计\\合成，引物序列见表1。