《表2 引物序列:丁酸梭菌对2种遗传背景仔猪肠道屏障功能的影响及其分子机制》

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《表2 引物序列:丁酸梭菌对2种遗传背景仔猪肠道屏障功能的影响及其分子机制》
《丁酸梭菌对2种遗传背景仔猪肠道屏障功能的影响及其分子机制》

采用实时荧光定量PCR检测肠黏膜中封闭蛋白1(claudin-1)、紧密连接蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、TNF-α、IL-8、Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、B细胞淋巴瘤蛋白3(Bcl3)、Toll作用蛋白(Tollip)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达,上述11个基因的上、下游引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表2;利用T165-48多样品组织研磨机对定量空肠和回肠样品破碎,用TacoTMRNA试剂盒提取仔猪空肠和回肠组织中总RNA,按照All-in-OneTMFirstcDNA Synthesis试剂盒说明书操作步骤将总RNA逆转录为cDNA。按照Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR反应体系的配制,以3μL cDNA为模板、最终反应体系为20μL进行PCR扩增,检测claudin-1、ZO-1、occludin、TNF-α、IL-8、TLR2、TLR4、MyD88、Bcl3和Tollip的mRNA相对表达水平。实时荧光定量PCR反应条件为:95℃10 min;95℃10 s,62℃20 s,72℃15 s并采集荧光信号,32个循环;72℃10 s,95℃10 s,自动采集荧光信号。每个样品均设置相应未经逆转录的模板作为阴性对照,同时每个样品均设置相应的内参作为对照,得到各自的荧光阈值循环数(Ct值),采用相对定量法2-△△Ct进行计算。

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