《具有免疫逃逸功能腺病毒载体的关键构建技术及应用》

器官移植是治疗终末期器官疾病的重要方法之一,但排斥反应是困扰器官移植的一大难题。同时基因治疗也面临同样的难题,载体蛋白和外源基因均会诱导宿主产生免疫反应,迅速被机体清除,成为临床应用的最大障碍。因此,通过基因修饰,减少机体对载体蛋白以及移植器官(或细胞)的排斥反应成为研究热点。

病毒为达到在宿主长期存活的目的可编码免疫逃逸基因逃避宿主免疫系统的识别和攻击,项目组筛选具有免疫逃逸功能的病毒基因构建于腺病毒载体,转染细胞(组织或器官)后可降低机体的免疫排斥作用,为基因治疗提供一种新的探索方向,为器官移植和自身免疫性疾病的治疗和预防拓展了更广阔的空间。

该项目的创新点主要包括以下几个方面:

(1)开发具有免疫逃逸功能的重组腺病毒载体的关键构建技术:首先筛选具有免疫逃逸功能的病毒基因(例如ICP47基因、US3基因等),PCR扩增后,采用His-tag的正、反义链退火后与扩增好的ICP47或US3基因片段链接构建融合基因的关键技术(方便后期蛋白纯化和检测,同时退火法操作简单,构建成功率大大提高),将融合基因连接于腺病毒载体,构建具有免疫逃逸功能的重组腺病毒载体,PacⅠ单酶切后脂质体转染于293细胞进行病毒包装,产生重组腺病毒并进行CsCl梯度纯化和滴度测定,收获具有免疫逃逸功能的重组腺病毒。

(2)提出病毒免疫逃逸基因在移植技术和基因工程治疗领域的应用新理念:通过CTL杀伤实验、树突状细胞DCs诱导的T淋巴细胞增殖能力实验、混合淋巴细胞实验和NK细胞杀伤实验等研究发现,表达病毒免疫逃逸基因的腺病毒载体能有效地介导转染细胞的免疫逃逸活性,降低机体免疫系统对转染细胞的排斥反应,有效逃逸宿主的免疫清除。这些研究成果为基因工程治疗领域和移植技术领域中降低排斥反应提供一种新的理论和探索方向。

(3)重组腺病毒载体的衍生技术及应用:成功构建的具有免疫逃逸功能的重组腺病毒载体由于带有His-tag易于进行蛋白纯化和检测,大大降低了科研工作量和蛋白检测成本,此外纯化蛋白后可进一步进行ICP47和US3抗体及相应ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒的研发,扩展其商业化应用。

(4)病毒免疫学的理论创新及开发利用的新视角:在病毒与宿主共生过程中,病毒通过不同途径逃脱宿主的消灭和清除,这些机制和模式值得人类探索并且用于造福人类。通过研究病毒的免疫逃逸机制,拓展病毒免疫学的研究领域,不仅为病毒的防治工作提供新的思路,并且在此基础上针对新的靶标设计新型抗病毒药物和开发高效、安全的新型疫苗。

应用推广及效益分析:已经与两家生物技术有限公司展开合作,提供重组腺病毒载体构建的技术支持服务,此外还开展了ICP47和US3蛋白的提纯、抗体及相应ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒的研发。此外成功构建的具有免疫逃逸功能的重组腺病毒载体为省内研究机构或医疗机构的研究人员提供重组腺病毒载体构建的技术支持服务,并进一步进行相应的免疫活性研究,取得良好的评价和使用效果,具有很好的经济效益和应用价值。

项目组研究成果通过省科技厅结项验收,并通过省级鉴定成果1项,鉴定意见为“达到国内领先水平”,获得河南省教育厅科技成果一等奖1项,优秀科技论文一等奖1项,二等奖1项,发表研究论文11篇,其中北大核心期刊论文8篇(其中中华系列期刊论文4篇),另有SCIE论文3篇,发表论著2部,河南省卫生厅医学科学技术进步三等奖1项。

成果说明

1.具有免疫逃逸功能腺病毒载体的构建技术为两家生物科技公司提供具有逃避免疫功能的重组腺病毒载体构建的技术支持和帮助,满足全省甚至全国更多科研人员工作的需要。此外带有His标签蛋白的融合基因可以简单快捷地进行目标蛋白的分离纯化和检测,降低蛋白的检测费用,缩减科研经费,受到实验室科研人员的欢迎和好评。目前郑州赛智生物技术有限公司已经开始利用表达His-tagICP47免疫逃逸基因的腺病毒载体以及抗体给其他医学实验室提供相关的技术和检测服务,目前已经收到了良好的经济价值和应用价值。郑州华兹生物技术有限公司利用构

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