《基于光学新技术及单细胞分析研究苏云金芽孢杆菌芽孢萌发机理与异质性》

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苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(简称Bt)是世界上生产规模最大、应用最广泛的微生物农药。中国是Bt制剂研究和应用大国。芽孢(Spore)是芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属和芽孢乳杆菌属细菌为应对不良生长条件而在细胞内形成的休眠体。由于含水量很低且富含2,6-吡啶二羧酸(dipicolinic acid,DPA)与钙离子(Ca<'2+>)的络合物CaDPA,芽孢对辐射、热、干燥、极端pH值、静水压和一些有毒化学物品等有很强的抵抗能力。芽孢对外界环境也很敏感,一旦感受到外部存在适宜萌发的条件,就开始萌发,恢复到营养细胞状态。芽孢萌发作为芽孢从休眠态向营养生长转变的关键起始,是认识芽孢抗性和寻找杀灭芽孢细菌的关键节点。该项目探索应用多光镊单细胞拉曼光谱、多细胞实时DIC显微成像等光学新技术,实时监测和分析单个Bt芽孢萌发过程,了解Bt芽孢的萌发规律和萌发机制、Bt芽孢萌发的异质性以及造成这种异质性的机理,了解物理、化学因子及农药制剂对Bt芽孢萌发的影响及其分子机制。项目获得了国家自然科学基金资助。该项目实施分为技术和应用两个层面。技术层面,建立了高通量、高分辨率的单个芽孢萌发实时动态监测系统,为大量分析单个芽孢萌发提供了便利;即使在512X512 pixels等较大视野下仍然可以达到30ms/帧,这对于监测变化迅速的生命单细胞的生理过程极为便利,已经扩展应用到家蚕微孢子虫孢子发芽机制的监测中。应用层面,完成了Bt芽孢萌发规律及其萌发特点的分析,发现了Bt芽孢与其它芽孢杆菌属(Bacillus)芽孢的相似与相异之处,对于有针对性地诱发Bt芽孢萌发,提高Bt发酵效率,提高Bt制剂的使用效率有重要的指导意义。发现不同培养条件、不同菌株、不同萌发剂都存在明显的异质性,芽孢的异质性主要体现在Tlag值上。说明引起Bt芽孢萌发的异质性因素很多,如何实现同一批芽孢尽可能同步萌发的目标依然很艰巨。完成了多种理化因子以及常规农药对Bt芽孢和芽孢萌发的影响及其机制分析,对于有针对性地开发有效的杀菌剂、或者在Bt芽孢生产与应用中避开这些影响因子有重要的应用意义。发现热激处理可以显著加快表面活性剂月桂胺对Bt芽孢的萌发;热激处理可能改变了芽孢内膜的结构或者流动性,这也可能是热激处理促进芽孢的营养萌发的机制;内膜是芽孢的非常重要的结构,上述发现为了解芽孢内膜的性质与功能提供了新的视角。发现芽孢萌发普遍存在的同质性事件:孢内CaDPA的完全释放前都有一个约为1min的极速释放过程,其释放进程仅受温度影响;因此促使芽孢完成萌发进程的重要任务就是令芽孢尽快进入CaDPA极速释放阶段,这可能是实现芽孢快速同步萌发的一个重要方向。成果对于有针对性地诱发Bt芽孢萌发,提高生物农药Bt的使用效率,提高Bt发酵效率、或者更好地杀灭芽孢有重要的指导意义,也为了解芽孢内膜的性质与功能提供了新的视角。项目成果也为抑制和预防医源、食物源芽孢杆菌提供了科学依据,为光学技术应用于生物医学在单细胞研究提供便利和借鉴。

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