淋病是一种在世界上广泛流行的性传播疾病,其发病率在中国性传播疾病中位居首位，给社会经济和生命健康带来了严重的危害。淋病的检测方法有直接涂片法、快速检查试纸片法、淋球菌培养法、基因测定法等多种。涂片法、试纸片法虽然操作简单，但准确率不高。淋球菌培养法和基因测定法虽然准确率高，但是样品的预处理要求高，设备要求高，测试时间也长，不适合基层医疗单位推广使用，也不适合于大规模样品的检测。近年来，随着技术的发展，研究人员尝试将免疫技术、胶体金标记技术、单克隆抗体技术联合运用，以研究更加简单易行、灵敏度高、特异性强的淋球菌检测方法。周旺等人利用淋球菌标准菌株，提取、纯化外膜蛋白复合物，并按免疫杂交瘤技术建立分泌抗P1单克降抗体的杂交瘤细胞株。用PIA和PIB作抗原产生的杂交瘤细胞株，其产生的McAb仅与同源的淋球菌发生特异性反应，而与非同源的淋球菌及其它类型的菌株不发生反应。沈建根等人用抗淋球菌单克隆抗体为包被抗体，以胶体金标记兔抗淋球菌IgG作探针，制成DIGFA反应盒，经51例临床分离株测定，准确率为98.04%。因此，将单克隆抗体、多克隆抗体和斑点免疫金渗滤试验结合运用，利用抗体的特异性和斑点免疫金渗滤试验的快速性，制备的淋球菌检测试剂盒具有很好的运用前景。前人在这方面已做了些基础研究，但是多选用淋球菌标准菌株或随意的一株临床菌株，来制备单克隆抗体，不具备地区代表性。对于胶体金标记的探针抗体多直接采用淋球菌提取的混合蛋白免疫，来制备多克隆抗体，特异性差。淋球菌是淋病的病原体，其主要外膜蛋白porinⅠ根据免疫及化学性质的不同,分为PIA和PIB两种类型,它们由一个单独位点的等位基因控制,通常一类菌株只表达其中一种。porinⅠ蛋白具有一定的免疫原性，是一个很好的候选抗原。但也纯在一定的抗原变异性，根据血清学分型，PIA又包括18个型别, PIB又包括28个型别，不同地区有不同的流行菌株，这为淋病的防治和临床诊断带来的困难。该课题拟收集浙江地区的淋球菌临床菌株，通过PCR技术检测临床菌株主要外膜蛋白porinⅠ的类别，再通过基因测序分析PIA和PIB各自的地区优势基因型。确定地区优势基因型后，敲除基因中的信号肽和跨膜序列，再构建PIA和PIB基因各自优势基因型的原核表达系统，诱导蛋白表达后，纯化PIA和PIB蛋白。以纯化的PIA和PIB蛋白分别做抗原，按常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。以纯化的PIA和PIB蛋白分别做抗原，免疫家兔，分别制备抗淋球菌PIA蛋白和PIB蛋白的多克隆抗体。以获得的抗淋球菌PIA蛋白和PIB蛋白的两种单克隆抗体作为包被抗体，以胶体金标记兔抗淋球菌PIA和PIB蛋白的多克隆抗体做探针，结合斑点免疫金渗滤试验，制备地区适用性强、简单易行、灵敏度高、特异性强的淋球菌临床检测试剂盒。该项目中的研究结果将以论文形式公开发表，预计在国内外学术期刊上发表论文2-3篇。该课题在课题组全体人员的共同努力下，已经按计划完成了所有的目标任务，达到了预期的目标和水平。在该课题的研究中，课题组收集了浙江地区经细菌培养法确诊的临床菌株43株，通过设计合适的扩增引物和porinⅠ基因类型检测引物，成功建立运用PCR技术对淋球菌临床菌株进行类别检测的方法，研究结果表明浙江地区的淋球菌临床菌株中，PIA类型占30.23%，PIB类型的占69.77%，浙江地区淋球菌临床株porinⅠ基因以PIB为主。通过基因测序的方式，分析PIA和PIB各自的地区优势基因型。序列分析表明，浙江地区PIA以血清型IA-6为优势基因型，PIB以血清型IB-3为优势基因型。课题组再以PIA和PIB基因的优势基因型序列为模板，敲除了序列头部的信号肽和跨膜序列，并优化基因序列后，成功的构建了它们的原核表达系统，并且通过镍琼脂糖亲和层析获得了纯化的PIA重组蛋白和PIB重组蛋白。以获得的纯化蛋白作为抗原，免疫兔子，成功的制备了兔抗PIA蛋白多克隆抗体和兔抗PIB蛋白的多克隆抗体，经间接ELISA检测，抗体效价均大于64000。再经Western blot检测表明，多克隆抗体全部出现明显的印记，说明制备的抗体特异性好，能够与抗原蛋白进行特异性结合。以获得的纯化蛋白作为抗原,通过常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。对于PIA蛋白，共获得8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用其中效价最高的细胞株注射腹水收集并纯化，获得了抗PIA单克隆抗体的效价大于128000。对于PIB蛋白，共获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选取其中效价最高的细胞株注射腹水收集并纯化抗体，获得了抗PIB单克隆抗体的效价大于256000。运用制备的单克隆抗体和多克隆抗体，结合斑点免疫金渗滤试验，成功制作了简单快速、灵敏度高、特异性强的淋球菌检测试剂盒。测试结果表明，试剂盒灵敏度高，待测样本中只要有62.5ng/ml的抗原蛋白，就能够形成明显的阳性结果。操作简单，检测反应一般能够在15分钟内完成。特异性好，没有和其它的病原菌发生阳性反应。准确率高，检测淋球菌临床菌株34株，经试剂盒检测显阳性的为33株，检出率97%。

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