《肝胆肿瘤诊断病理学及分子病理学特征的系列研究》

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1993年1月1日~2003年5月31日,由国家自然科学基金、军队医药卫生杰出中青年基金及上海市卫生系统百名优秀跨世纪学科带头人培养计划资助,对肝胆肿瘤的诊断病理学及分子病理学特征,进行了研究。一、方法:应用微组织切割基础上的聚合酶链反应(PCR)-脱氧核糖核酸(DNA)基因组测序技术、DNA倍体分析技术、p53基因突变差异位点模式分析及免疫组织化学技术等方法,对1980年1月~2002年12月该院手术切除的5000余例肝胆肿瘤的病理标本进行了肿瘤病理学类型、生物学行为、组织病理学、免疫病理学、分子病理学及其临床病理学特点的系统研究。

二、结果:(一)肝细胞癌临床病理生物学特征:在5000余例手术切除肝细胞癌(HCC)的外科病理学特征研究的基础上,分别研究了女性肝癌、老年肝癌、青年肝癌、儿童肝癌、小肝癌、复发性肝癌以及少见组织学类型肝癌的外科病理学特征。1.提出瘤体直径<3cm小肝癌的5个基本病理生物学特征是:(1) DNA含量以二倍体为主,癌细胞分化程度较高,生长相对缓慢。>3cm大肝癌DNA含量以非整倍体为主,癌细胞分化程度较差,生长迅速。(2)以膨胀性生长为主,多有包膜形成。(3)病灶单个、局限,一般以包膜内侵犯为主。(4)癌栓发生率低,癌旁极少有>2cm范围的卫星灶。(5)手术可以根治性切除,术后复发率低,生存期较长。并提出以癌体直径<3cm作为小肝癌的体积标准,基本可以反映处于早期相对良性发展阶段生物学特性的新概念,这一时期是DNA倍体开始从二倍体→非整倍体的转变,生物学特性开始从早期相对良性阶段向晚期明显恶性阶段发生演变的一个重要时期,也是经手术切除可望获最佳疗效的时期。通过对小肝癌包膜形成的病理观察,提出早期小肝癌包膜形成经过无包膜期、包膜形成期和包膜突破期三个阶段。鉴于包膜突破期时,部分小肝癌可以较早进入恶性演进阶段,因此在小肝癌手术时,应尽可能保留2cm以上的切除范围以达到根治性治疗效果。2.筛选肝细胞癌和肝内胆管癌的免疫病理表型谱系,提出肝细胞癌以Hep Par1和CD34作为一线标记抗体,以多克隆癌胚抗原(pCEA)和甲胎蛋白(AFP)作为二线抗体。在肝内胆管癌中,以CK19作为一线标记抗体,以CA19-9作为二线抗体的免疫组化策略,特别提出CD34单抗“肝细胞癌型染色”的新概念作为诊断参考依据,采用这一免疫组化谱策略,可基本解决肝脏最常见良性肿瘤与肝细胞癌和肝内胆管癌之间以及与转移性肝癌之间的免疫病理诊断和鉴别诊断。3.用自建的双重原位分子杂交法,发现肝癌细胞内同时存在乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)、或HBV/C-myc双重杂交信号,为揭示HBV和HCV的双重致癌作用机制提供了重要的分子依据。4.在术后复发性肝癌DNA倍体模式以及p53基因突变差异位点的检测基础上,提出复发性肝癌中存在单克隆和多克隆两种起源方式,前者与首次切除的原发性肝癌为同一克隆起源,而后者则与首次切除的原发性肝癌为不同克隆起源,经再次手术切除,仍可获得与首次原发性肝癌切除相同的疗效。该理论为复发性肝癌再手术治疗提供了科学依据。(二)肝癌分子病理学特征:用微量组织切割基础上的PCR-DNA 直接测序、毛细管电泳测序和RAPD(随机扩增多态DNA)等分子生物学技术,对肝癌和肝内胆管癌的肿瘤抑制基因杂合性缺失(LOH)、微卫星不稳定性(MSI)与单核苷酸多态性(SNP)变异特点的研究中,发现:1.肝癌和肝内胆管癌之间肿瘤抑制基因(TSG)和微卫星存在明显不同的LOH,6种肿瘤抑制基因LOH和Ki-ras-2突变发生率在肝癌中为∶p53(87.5%)、 APC(58.8%)、OGG1(50%)、RB1(37.5%)、DCC(25%)、MCC(0.0%)、Ki-ras-2(0.0%); 在肝内胆管癌为:APC(68.8%)、DCC (46.2%)、 OGG1(41.7%)、p53(37.5%)、Ki-ras-2(27.3%)、RB1(22.2%)、MCC(14.3%),提示这两种肝脏常见肿瘤发生的分子机制和分子路径不同。2.基因组DNA测序和错配修复基因蛋白hMLH1和hMSH2免疫组化检测证实,肝癌和肝内胆管癌的基因组不稳定具有“高LOH、低MSI” 的特性,为进一步认识肝癌的发生机制提供了新的认识。3.发现OGG1基因在肝癌和肝内胆管癌组织中具有较高的缺失率,从而表明DNA氧化损伤也是导致肝细胞和胆管上皮细胞基因组不稳定性的重要机制之一。4.发现肝癌和肝内胆管癌的分子变异谱与肿瘤的临床发展和演进阶段有关,其中APC、DCC和0GG1基因LOH主要在肝癌演进的早期发展阶段起作用,而p53和RB1则主要在晚期演进阶段起作用。两组肝癌患者的术后平均生存期分别为72.0±38.6月和51.0±30.4月,P<0.05。这一发现为从分子病理学角度评估肿瘤的演进状态和临床病理分期提供了新的指标。5.肝癌染色体某些特定区域的微卫星变异与肿瘤体积、分化程度、包膜突破及转移相关。如微卫星D4S426与肝癌分化程度有关、D17 S 926与瘤体体积有关等,为评估肝癌的生物学行为提供了有实际意义的分子标志物。6.在500余例肝癌大样本研究基础上,研究了一组重要基因SNP位点特征与肝癌风险度的关系中,证实p53基因第72密码子单核苷酸多态性(Arg/Pro)与肝癌遗传易感性之间有关,与Arg等位基因相比,若该密码子呈现Pro等位基因,则提示是HCC发生的危险因素。提示这一指标可作为新一代分子标志物,用于肝癌高危人群的筛选,进而为早期发现肝癌提供了新的途径。(三)肝脏肿瘤诊断的外科病理学:5000余例手术切除各类肝胆肿瘤中,于国内较早诊断了许多罕见肝脏病变。其中有肝血管平滑肌脂肪瘤、胆管腺瘤、肝婴儿血管内皮瘤、肝脂肪瘤等近10种肝脏良性肿瘤。有肝类癌、肝淋巴瘤、肝上皮样血管内皮癌等10多种肝脏恶性肿瘤,其中肝细胞癌又细分出10多种组织和细胞学亚型,如提出泡沫细胞型和菊花团型等新的肝癌组织学类型。目前报道了源于全部三个胚层来源的肝脏原发性肿瘤,重点研究了肝脏原发性间叶性肿瘤的组织病理学诊断、鉴别诊断及免疫组化特点。发现肝脏良性间叶性肿瘤以肝血管平滑肌脂肪瘤最为常见,根据 12例手术切除肝原发性恶性淋巴瘤统计,发现全部肝淋巴瘤患者均为男性,其中58.3%合并有HBV感染,提示肝淋巴瘤的发生与HBV感染或激素水平有一定关系。在此基础上,将肝脏和肝内胆管系统的良、恶性肿瘤按组织来源进行分类,详细论述了各病变的发生机制、临床特点、组织病理类型和鉴别诊断特点等,编写专著。三、推广应用:(一)在国内外专业杂志上发表有关论文80余篇;编写出版首部《肝胆肿瘤病理学彩色图谱》(上海科技文献出版社,1998年)和《肝胆肿瘤诊断外科病理学》(上海科技教育出版社,2002年);参编4部肝脏外科专著中有关肝脏肿瘤和肝脏移植病理章节。(二)近5年在国际性、全国和全军学术大会报告12次,其中大会特邀报告5次。(三)2002年10月成为中华医学会病理学分会“全国肝胆肿瘤及移植病理协作组”的组长单位,各组员单位正按照《肝胆肿瘤诊断外科病理学》中小肝癌和肝脏移植并发症的病理诊断标准,开展全国范围的小肝癌和肝脏移植病理材料的研究总结,以推动肝脏病理学科的发展。(四)培养硕士研究生6人,博士研究生3人,博士后1人。已完成2004年国家级医学继续教育项目-全国肝脏病理学习班的项目。

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