《重组蛋白含MAR高效载体分子组装优化及其应用》

一、项目背景和意义:

重组蛋白药物是生物医药产业的重要部分,其中70%左右是用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的。由于转基因沉默导致的重组蛋白表达水平较低已经成CHO细胞生产重组蛋白药物的瓶颈和“卡脖子”技术。国内动物细胞培养技术落后,重组蛋白表达水平低、远落后于欧美发达国家,这一现状极大地制约了中国重组蛋白药物产业化的发展。因此,建立具有自主知识产权的CHO细胞表达系统,用于重组蛋白药物的生产将具有重大科技创新意义。

二、项目主要科技创新:

该项目在国家自然科学基金和河南省科技创新人才项目资助下,在前期研究基础上,系统优化了CHO细胞表达载体及表达系统,主要创新点有:(1)系统优化了MAR表达载体及与其他调控元件的分子组装,筛选出了CHO细胞高效表达载体。该项目从核基质结合区(MAR)序列、启动子、内含子、PolyA、IRES、UCOE、抗阻遏元件、绝缘子、筛选标记等调控元件全面对表达载体进行了优化,并对其分子特性进行了研究。共设计构建了三百余个载体,筛选出近三千个细胞池(cell pool)、一万三千多个单细胞克隆,从中筛选出了适合CHO表达系统的高效表达载体。(2)研发出无血清培养基及新型缺陷型CHO细胞系。用该项目研发的培养基培养的CHO细胞其细胞密度、细胞活性及重组蛋白表达水平均高于国际知名企业的同类产品。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了新型DNA甲基转移酶Dnmt3a缺陷型细胞系,可以显著提高重组蛋白的长期表达稳定性。(3)系统测试了构建的表达系统,建立了高效CHO细胞表达系统。采用该项目研发的含MAR元件表达载体、缺陷型细胞系及无血清培养基进行了重组蛋白表达水平测试和工艺优化。结果表明,重组抗体如阿达木抗体、西妥昔抗体的cell pool表达水平高达3.0g/L以上,单克隆细胞表达在15.0g/L以上(显著高于3.0g/L的单克隆细胞表达水平)。重组蛋白如EPO、乙肝疫苗表达水平分别在200mg/L、300mg/L以上,均显著高于文献报道及生物制药企业的重组蛋白表达水平,处于国际先进地位。比优化之前的表达水平提高5.37倍。生产重组蛋白、重组抗体仅培养基就可降低80%的使用量,如生产100g重组阿达木抗体使用传统CHO细胞表达体系需要35L培养基,而使用该项目研发的CHO表达系统仅需要7L左右,按照目前的无血清培养基市场售价1577元/L,可以节约培养基成本4.4万元。如使用5000L反应系统,一个批次的工业生产便可降低培养基成本630万元,加之其他成本如人力、水电、原材料等消耗,节约成本在800万左右。

三、项目科技成果及应用情况:

该项目获得已授权发明专利4项、发表SCI收录论文8篇、已申请国家发明专利3项、并且实现了2项技术转移。无血清培养基等项目科技成果已在华兰生物疫苗有限公司、南京科佰生物科技有限公司等公司进行应用,已实现经济效益1796万元。该项目的完成,对于建立具有自主知识产权的重组蛋白表达系统具有重要的意义和应用前景。

成果说明

该项目取得的科技成果的推广具有广阔的应用前景。目前重组药物蛋白表达系统所用细胞培养基的市场被Thermo、Lonza、Selexis和Merck公司这四大公司所垄断,国内缺少具有自主知识产权高效CHO重组表达系统,尚没有能够大规模生产细胞培养基的厂家。目前中国市场的细胞培养基年需求量在900~1000吨,其中95%的培养基从美国Invitrogen/GIBCO、西格玛SAFCBio和海克隆Hyclone等公司进口。本项目自主研发的重组蛋白表达系统在实验室和国内知名生物医药公司的检测评估和使用过程中均获得了

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