《表1 实验所用基因引物序列信息Tab.1 Primer sequences used in present study》

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《纳米二氧化硅和铅复合暴露对斑马鱼幼鱼甲状腺内分泌系统的毒性影响》

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RNA的提取、纯化和定量以及cDNA的合成和目的mRNA的表达检测按照Chen等[18]的方法。将约30条幼鱼在低温条件下充分匀浆后，用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）抽提总RNA。选取基因的引物序列是从Primer 3（http://frodo.wi.mit.edu/）设计，引物序列见表1。在进行mRNA的检测之前，我们还评估了较为常用的五个内参基因（rpl8，18s，β-actin，gapdh，ef1α）在Pb暴露下的转录稳定性，内参基因的转录稳定性评估选用geNorm在线分析在线工具（http://medgen.ugent.be/genorm），结果显示β-actin在Pb单独暴露及复合暴露中都是最稳定的，因此最后选取β-actin作为内参基因。定量PCR采用日本Toyobo公司的SYBR Green试剂盒，总反应体积为20μL，体系如下:10μL 2×SYBRGreenMasterMix、上下游0.5μM的引物各0.5μL、cDNA模板2μL，超纯水定容至20μL。于ABI 7300（Perkin-Elmer Applied BiosysTems）进行PCR反应检测。扩增程序为:95℃×10 min变性；95℃×30 s、60℃×15 s、72℃×45 s，40个循环。反应结束后绘制溶解曲线用于检验是否有非特异性产物。对照组和每个暴露浓度组中均设置3个平行样，每个样品2个重复。目的基因转录水平的相对变化使用2-△△CT法进行计算处理。