《表1 RT-PCR实验AR、SKP2引物序列》

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《AR和SKP2在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义》

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（1） 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术是利用抗原抗体特异性结合的原理对组织细胞内的蛋白进行定性、定位或半定量的研究，该技术组织形态学保存完整，蛋白定位直观清晰，在进行形态与功能相结合的研究时具有重要意义；石蜡包埋标本能长期保存，连续切片。因此笔者对96例TNBC及35例良性乳腺病变的石蜡包埋标本采用了IHC法检测AR、SKP2的蛋白表达情况:1) 为避免传统石蜡切片进行IHC时出现的费时费力、染色结果存在批次时间误差等缺点，本实验将所有纳入的石蜡包埋标本制成组织芯片。根据HE切片选取1～2个典型的肿瘤区域，在原始蜡块上标记相应的打孔位置。构建10×6的微阵列设计图，在原始蜡块的标记位置钻取直径2mm的组织芯1～2条，严格按照微阵列设计图包埋组织芯。将组织芯片以3μm厚度连续切片，裱于涂胶玻片备用。2) 按照IHC中的Envision两步法检测AR、SKP2。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知AR阳性的睾丸组织和Skp2阳性的肾透明细胞癌作阳性对照。（2）Western blot法是对组织细胞内提取的蛋白凝胶电泳处理后，用特异性的抗体检测某特定抗原的一种蛋白质定量检测技术。本实验对20例新鲜TNBC及5例对照癌旁组织采用Western blot法检测组织内AR、SKP2蛋白的表达情况:（1）取50mg冻存组织剪细后RIPA冰浴下匀浆，低温高速离心后取上清液，BCA法测定蛋白浓度；（2）取等量蛋白水煮变性后依次恒压电泳、转膜；（3）脱脂奶粉封闭，滴加一抗（AR 1∶200；SKP2 1∶1000）、二抗，摇床孵育，ECL显色；（4）暗室曝光，扫描成像。内参为GAPDH。（3）RT-PCR是以mRNA反转录产生的cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增以检测目的基因表达水平的一种分子定量技术。本实验拟采用该技术对20例新鲜TNBC及5例对照癌旁组织检测AR、SKP2的mRNA表达情况:（1）根据NCBI网站公布人类AR、SKP2基因序列设计引物（表1），引物由上海轶沤生物科技公司合成；（2）取50mg冻存组织剪细后相继加入TRIzol、氯仿、异丙醇抽离总RNA，洗涤干燥后溶解RNA并测定浓度；（3）按照反转录试剂盒说明合成cDNA；（4）以cDNA为模板根据PCR试剂盒说明进行扩增。所有样本均设3个复孔，结果取3次平均值，每次反应均设空白对照，内参为GAPDH。该实验重复3次。