《表2 感染实验分组和感染条件》

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《利用慢病毒载体建立fractalkine基因敲低的HK-2稳定细胞株》

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通过感染预实验确定慢病毒载体对HK-2细胞株的最佳感染条件（细胞数量、感染试剂、感染后换液时间等）和感染复数（MOI）。实验分组及具体操作步骤如下：（1）合适感染条件确定：为了确认合适的感染条件，按照不同培养条件将实验分为5组：常规培养基组（A组），观察常规培养条件下病毒对细胞的感染效果；常规培养基+Polybrene组（B组），观察Polybrene是否可以提升感染效果；ENi.S.组（C组），观察用ENi.S.替代常规培养基时病毒对细胞的感染效果；ENi.S.+Polybrene组（D组），观察Polybrene和ENi.S.条件下病毒对细胞感染效果；常规培养基+阴性对照病毒（E组）；Control组，监控实验过程中细胞生长是否正常（表2）。（2）感染：接种细胞，用完全培养基制备2ml密度3～5×104个/ml的细胞悬液，取100μl/孔加入96孔板中，共15孔，其中3孔作为Control组，继续培养；第2d用ENi.s将慢病毒依次稀释成1×108 TU/ml（MOI=100）、1×107 TU/ml (MOI=10）、1×106TU/ml (MOI=1），各50μl；继而用ENi.S将Polybrene稀释成50μg/ml，共200μl，标记为P（E）；用常规培养基将Polybrene稀释成50μg/ml，共200μl，标记为P（M）；吸掉上清液，并按照表2向各孔中加入相应体积的溶液，混匀，继续培养；感染后12h换回常规培养基，过程中观察细胞形态。（3）感染效果检测：第5d（感染约72h后）荧光表达丰度较高时，用显微镜观察感染效果。感染效率80%左右，且细胞生长良好的组所对应的感染条件和MOI即可以作为后续感染实验的依据。（4）筛选：在6孔板中采用LV-FKN-RNAi感染HK-2细胞，按照感染预实验的最佳感染条件及MOI，在完成感染72h后加入终浓度8μg/ml的Puromycin对细胞进行筛选，3d后减少Puromycin的浓度至0.5μg/ml并维持此浓度培养1周，获得HK-2/LV-FKN-RNAi细胞株，通过Western blot验证结果。