《表1.跨越损伤合成活性底物序列》

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《Sulfolobus acidocaldarius DNA聚合酶Ⅳ跨越损伤合成能力的酶学特征》

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将表达载体pET28-SacpolIV转入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，菌体逐步扩大培养至200 mL液体LB（含50μg/m L卡那霉素）培养基中。待OD600达到0.6–0.8时，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG（Isopropy-β-D-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷），20°C培养16 h，诱导重组蛋白表达。将菌体沉淀悬浮于30 mL裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，2 mmol/L PMSF，10%甘油）。按如下条件冰上超声裂解细菌:600 W功率下超声3 s，间歇2 s，共超声裂解30 min。将细胞裂解液70°C温育20 min，失活绝大部分大肠杆菌自身蛋白（SacpolIV为热稳定性蛋白），在4°C下8000 r/min离心30 min，收集上清液。预先用5倍树脂体积的裂解缓冲液平衡Ni-NTA树脂30 min。将上清液倒入平衡好的树脂中，然后分别用含10、20、40 mmol/L咪唑的裂解缓冲液梯度洗涤树脂，除去非特异性结合的杂蛋白，再用5 mL洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，10%甘油）洗脱目标蛋白，1 mL/管分步收集。通过SDS-PAGE检测纯度后，透析法除去咪唑，并最终交换到储存缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，100 mmol/L NaCl，50%甘油）中，于–20°C保存。Brandford法测定蛋白浓度。