《表2 wl-1定位标记及相关qRT-PCR引物》

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《一个调控水稻叶绿素合成基因wl-1的精细定位》

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突变体wl-1和野生型的叶片总RNA采用Trizol法提取，将样品移至预冻的研钵中加入液氮磨成粉末状并迅速转移至1.5 mL离心管中（样品体积约50～100 mg），加入1 mL Trizol后室温放置5 min，12 000 r/min离心5 min，吸800μL上清至新的离心管中并加入200μL氯仿，室温放置15 min后4℃下12 000 r/min再离心15 min，吸上层水相至新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置10 min，4℃下15 000 r/min离心10 min，弃上清加入1 mL 75%乙醇，悬浮沉淀，4℃下8 000 r/min离心3 min弃上清，RNA沉于管底，室温晾干3～6 min后加入20～30μL DEPC水，所用提取试剂购买于北京鼎国生物有限公司。用DNaseⅠ处理叶片总RNA并以此为模板，用ReverTra Ace qPCR RT Kit（Toyobo）反转录成c D-NA。利用实时荧光定量PCR仪分析wl-1目标基因以及其他叶绿素合成、叶绿体发育以及光合作用相关基因在突变体和野生型中的表达量。内参基因为Actin，采用2-△△ct计算基因的相对表达量。Real-Time qPCR反应体系总体积为20μL:其中加入cDNA模板4μL，2×SYBR Primix Ex TaqⅡ为10μL，前后引物（10μmo/L）各1μL，ddH2O为4μL，每个样品均做3次重复（表2）。定量程序包括:30 s的95℃下预变性；5 s的95℃下变性，30 s的58℃下退火，15 s的72℃下延伸，共40个循环。PCR结束后，用Roche Light Cycler自带程序计算溶解曲线，然后导出数据并在Excel中进行处理。