《表2 小鼠胚胎显微注射Cas9 mRNA和sgRNA统计》
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《应用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应》
应用CRISPR/Cas9做基因敲除时,只有合理设计sgRNA,才能将靶基因彻底敲除。根据经验,将sgRNA设计在目标基因编码序列(coding sequence,CDS)的前1/3处时,在该处切割,发生DNA双链断裂,通过机体NHEJ修复,产生移码突变,能够导致基因彻底敲除;如果sgRNA距起始密码子ATG太近,机体会在起始密码子下游找到另一ATG充当起始密码子,仍会合成有功能的蛋白;而如果sgRNA距起始密码子ATG位置太远,会导致该基因前面的功能域保留,致使敲除不彻底。根据以上原则,结合报道的Paired sgRNA/Cas9-D10A设计策略[11],本研究将1对sgRNA设计在Nsun5基因3号外显子上(图1A),通过体外转录得到Cas9 mRNA、Cas9-D10A mRNA和sgRNA,利用原核注射技术体外将转录的RNA注射到小鼠一细胞期受精卵中,移植后,Cas9/sgRNA组出生17只首建鼠;Cas9-D10A/sgRNA组出生7只首建鼠(表2)。
图表编号 | XD00224215300 严禁用于非法目的 |
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绘制时间 | 2020.09.15 |
作者 | 王仿竹、陈红全、王建瑛、沈彬 |
绘制单位 | 南京医科大学生殖医学国家重点实验室、浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科、南京医科大学生殖医学国家重点实验室、南京医科大学生殖医学国家重点实验室 |
更多格式 | 高清、无水印(增值服务) |