《表1 构建目标菌株所用引物[22]》

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《cel-EIIB蛋白调控罗非鱼无乳链球菌强毒、弱毒株毒力相关基因的表达模式》

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参照Xu等[22]的方法，如图1所示，采用同源重组方法构建无乳链球菌弱毒株cel-EIIB基因缺失株，以提取无乳链球菌TFJ0901基因组DNA为模板，分别用cel-EIIB基因上下游同源臂特异性引物（表1） Ust-F/R和Dst-F/R扩增出相应片段，通过融合PCR将上下游片段融合并与质粒连接，用抗氯霉素基因cat引物（表1） cat-R/F从质粒p SET5s获得cat基因，用cat代替cel-EIIB基因，同时与抗壮观霉素温敏自杀质粒p SET4s连接获得重组质粒p SET4s-Ust-cat-Dst，进行测序验证。用电转染的方法将其转入TFJ0901感受态细胞中，28℃下，在加入氯霉素的BHI培养基中经数次培养以促进同源重组，选择对氯霉素产生抗性且对壮观霉素敏感的菌株，获得缺失株△cel-EIIB TFJ0901，用cel-EIIB基因特异性引物EIIB-F/R（表1）进行PCR扩增和测序验证，连续传代检测突变株的遗传稳定性。