《表1 基因枪转化小麦p AHC20或Ubi-bar∶Ubi-gus摩尔比优化》

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《基因枪介导的普通小麦共转化体系的优化》

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基因枪转化及筛选过程参照Sparks和Jones（2009；2014）的方法略有改动。取50μL直径0.6μm金粉颗粒悬浮液（20 mg/m L），加入4μL总浓度1 g/L的混合质粒DNA （p AHC20或Ubi-bar与Ubigus分别按摩尔比1∶1，1∶2，1∶3混合，见表1），在2.5 mol/L氯化钙50μL，0.1 mol/L亚精胺20μL的参与下沉淀并包被在金粉粒（Bio-Rad，美国）上，将包被有DNA的金粉悬浮液用150μL无水乙醇清洗2次，最后悬浮于85μL无水乙醇中，置冰上待用。将包被有目的基因的金粉悬浮液均匀涂于载体膜，每片5μL，放置数分钟后用于轰击，每次涂液前将悬浮液重新悬浮使之混合均匀。所用基因枪型号为PDS-1000/He （Bio-Rad，美国），轰击压力650 psi（pounds per square inch），基因枪真空度27 in Hg （=9.142×10-2 MPa），阻挡膜与外植体间距5.5 cm，7个独立实验组合，共进行了4次重复实验，每次实验每个组合各重复4次。幼胚在高渗培养基（9%MS）上预培养4 h后进行基因枪轰击，以未轰击和只用金粉粒子轰击的外植体为阴性对照。将轰击后的幼胚转至4.5%MS诱导培养基，22℃暗培养21 d，转至草丁磷（phosphinothricin，PPT）抗性筛选分化培养基RDZ （乳糖亚硫酸盐培养基+5 mg/L玉米素+0.1 mg/L 2，4-D，R medium+5 mg/L zeatin+0.1mg/L 2，4-D）上，经过2轮抗性筛选，第1轮选择压为3.0 mg/L，第2轮选择压为4.0 mg/L，每次3周，直到对照的外植体变为褐色停止生长，将筛选获得的抗性愈伤组织转至无草丁磷的R培养基上进行生根壮苗培养，1～3周后，将生根的植株移入土质肥沃的花盆，在温室中生长至成熟（Henry，Furtado，2014）。