《表1 基因克隆及表达分析引物列表》

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《虎奶菇多功能过氧化物酶的基因克隆和表达分析》

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将虎奶菇接种在PDA平板上，32℃培养7 d，当菌丝长满平板时，收集菌丝。采用CTAB法[15]提取总DNA，采用RNAiso Plus法[16]提取总RNA，提取后的总DNA和RNA分别用核酸测定仪及1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度、浓度及完整性。随即，使用Takara公司的Prime Script?II 1st Strand c DNA Synthesis Kit合成c DNA。根据NCBI数据库已报道的多个白腐菌VP基因序列的保守区，设计简并引物Deg-v F/Deg-v R（表1），以虎奶菇c DNA为模板，PCR扩增VP的保守序列。20μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μL，d NTPs（2.5 mmol/L）0.8μL，Deg-v F/Deg-v R（10μmol/L）各1μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2μL，c DNA 1μL，dd H2O 14μL。PCR反应条件：95℃5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃5 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测确定目的条带后，对目的条带进行回收、将回收产物与p MD18-T克隆载体连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌落PCR后选取阳性转化子送往天一辉远有限公司测序。