《表1 实时荧光定量PCR引物序列及大小》

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《不同阶段骨关节炎滑膜组织中肾素、血管紧张素转换酶及血管紧张素受体1、2的表达研究》

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1.3.1实时荧光定量PCR检测取各组滑膜组织标本用TRIzol溶液提取总RNA，然后按试剂盒说明书逆转录成cDNA，将目的基因进行转录扩增，反应条件：94℃预变性2 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，总共循环50次。PCR引物序列见表1。按照2-ΔΔCt值计算法，以GAPDH为内参，计算Renin、ACE、AT1R及AT2R mRNA相对表达量。1.3.2 Western blot检测取各组滑膜组织标本置于RIPA缓冲液中进行匀浆，4℃以离心半径5 cm、13 000 r/min离心15 min，取上清；采用BCA蛋白试剂盒测定总蛋白浓度。使用12%SDS-PAGE分离总蛋白，并在250 mA、2 h条件下将蛋白转移到硝酸纤维素膜。室温下，将膜置于含5%脱脂牛奶的TBST封闭1.5 h；4℃下与Renin(1∶1 000）、ACE(1∶1 000）、AT1R(1∶1 000）、AT2R(1∶1 000）、GAPDH(1∶1 000）一抗孵育过夜；与相应的抗兔/抗鼠二抗孵育1.5 h。将条带与化学发光试剂显影免疫复合物结合观察，采用Image J软件分析灰度值。以与GAPDH条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。