《表1 引物序列与real-time PCR反应参数》

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《梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定》

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以正常猪卵丘颗粒细胞cDNA为模板，使用表1中的引物和PrimeSTAR HS高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增。PCR产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。回收后的目的基因片段和pMD19-T克隆载体进行连接。用PCR法鉴定出连接成功的阳性克隆后，送到上海生工生物公司测序[14]，筛选出特异性的引物后进行荧光定量PCR反应。反应体系：12.5μL FS Universal SYBR Green Master(ROX）、0.5μL上游引物（10μmol·L-1）、0.5μL下游引物（10μmol·L-1）、2μL cDNA(1 ng·μL-1）样品和9.5μL Nuclease-Free H2O。荧光定量PCR反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性30 s、60℃退火及延伸30 s，45个循环。每个循环的退火及延伸阶段采集荧光信号数据。扩增结束后立即进行熔解曲线分析，根据熔解曲线判断反应的特异性，根据每个样品的Ct值，用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，每个试验样品设置3次重复，同是有3个生物学重复。