《表1 F0代小鼠序列突变情况》

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《PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证》

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Note:The gray area is labeled as the guideRNA target site；the underline is labeled as the PAM sequence；the“”is labeled as the missing sequence，and the bold is labeled as the inserted sequence

PD-L1基因敲除小鼠的构建策略如图1所示，通过显微注射方式将Cas9 mRNA和针对PD-L1 sgRNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中，Cas9/sgRNA复合物可将PD-L1基因exon 3、4、5切除，exon3、4、5编码了PD-L1蛋白的胞外区和跨膜区，该区域的缺失将造成CD274蛋白的功能性缺失。用体外转录获得的Cas9 mRNA和sgRNA共注射了180枚受精卵，注射后的受精卵移植到6只假孕鼠中，其中5只小鼠妊娠并出生36只小鼠（出生率为20%），经PCR鉴定及PCR产物测序确认，共获得28只F0代阳性小鼠（阳性率为77.8%），其中雄鼠17只、雌鼠11只。F0代阳性小鼠鉴定策略和PCR电泳图分别如图2a、b所示。F0代阳性小鼠经过测序确认，最终选择4号F0小鼠与8周龄C57BL/6雌鼠交配，4号F0代小鼠缺失9 240bp并插入CG双碱基（表1）。F1代阳性小鼠PD-L1基因型分析结果均和F0代相同。F1代杂合子小鼠经自交获得F2代纯合子小鼠。F2代小鼠基因型鉴定结果如图3所示。