《表2 相对利用率(UDP-GlcNAz/UDP-GlcNAc)》

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《OGT结构改造对糖探针GlcNAz利用率的影响》

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前期工作表明s OGT无论以多肽还是蛋白为底物都有很好的活性[20-21]，因此选择s OGT为目标蛋白，在多肽、蛋白等不同底物水平进行活性检测.在分子对接基础上，本研究构建了3种突变体:M130A，Y470A及M130A/Y470A，表达纯化后，分别以FITC-八肽为底物进行体外糖基化反应并用HPLC测定产率.HPLC分析结果显示:FITC-八肽原料的保留时间Rt=19.2 min，而在相同洗脱条件下，O-Glc NAc修饰的FITC-八肽的保留时间Rt=17.9 min，O-Glc NAz修饰的FITC-八肽的保留时间Rt=19.1 min（图2A），保留时间的提前可能与糖基化修饰后肽段极性增强相关.为了进一步确定产物峰，本研究通过ESI质谱进行了鉴定.发现保留时间Rt=17.9 min处的峰产物对应的分子离子峰为[M+H]+=1 567.87，与O-Glc NAc修饰八肽的理论分子量（1 567 Da）一致（图2B左）；保留时间Rt=19.1 min处的峰产物对应的分子离子峰为[M+2H]2+=805.15，与O-Glc NAz修饰八肽的理论分子量（1 609 Da）一致（图2B右）.HPLC分析结果表明:当以UDP-Glc NAc为糖供体时，野生型s OGT、M130A、Y470A所催化反应产率分别为95%、52%和45%.但双突变体M130A-Y470A没有活性（结果未显示）.当以UDP-GlcNAz为糖供体时，野生型sOGT、M130A、Y470A所催化反应产率分别为100%、79%和77%，表明两种突变体对UDP-Glc NAz的利用率有所下降.但综合比较各突变体对两种糖供体的利用率会发现:相对于s OGT，突变体M130A、Y470A对UDP-Glc NAz相对利用率均有所提高，分别提高了1.45、1.63倍（表2）.