《表1 基因克隆引物及荧光定量引物》

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《大豆抗SC3候选基因的克隆及分析》

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引物名称中含有q PCR的为实时荧光定量引物。

由于GmR47及GmR51具有高度同源性，故采用特异性较高的巢式PCR（Nested-PCR）进行扩增。以NCBI上公布的Williams 82基因组Wm82.a2.v1数据库为参考，利用Primer premier 5软件设计引物（表1）。首先使用引物对GmR47-1和GmR51-1进行第1步PCR，反应体系为50μL，包含酶25μL2×PrimerStar Master Mix（Takara）、上下游引物（浓度为10μmol L-1）各1μL、模板cDNA 1μL、灭菌ddH2O22μL。PCR程序为95℃3 min；98℃10 s，58℃15s，72℃45 s，30个循环；72℃5 min。然后使用引物对GmR47-2和GmR51-2进行第2步PCR，反应体系为50μL，包含酶25μL 2×PrimerStar Master Mix（Takara）、上下游引物（浓度为10μmol L-1）各1μL、模板为第1步PCR产物稀释100倍后取1μL、灭菌ddH2O 22μL。反应程序同上。利用琼脂糖凝胶电泳法检测第2步PCR反应产物，回收条带大小正确的产物。并将回收产物使用T4连接酶连接至T-easy载体pMD20-T，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α中过夜培养，挑取单克隆，将检测为阳性的单克隆送至通用生物公司测序。